Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

A-1 sjabloan

■ De sjabloan befettet proteïne -ûnreinheden as Taq -ynhibitoren, ensfh .——Zuiverje DNA -sjabloan, ferwiderje proteïne -ûnreinheden of extract sjabloan -DNA mei suveringskits.

■ De denaturaasje fan sjabloan is net kompleet —— Passend fergrutsje denaturationstemperatuer en ferlingje denaturationstiid.

■ Degradaasje fan sjabloan —— Stel de sjabloan opnij foar.

A-2 Primer

■ Slechte kwaliteit fan primers —— Re-synthesize de primer.

■ Degradaasje fan primer ——Aliquotearje de primers mei hege konsintraasje yn lyts folume foar behâld. Foarkom meardere beferzen en ûntdûke as lang termyn 4 ° C kryopreserveare.

■ Unjildich ûntwerp fan primers (bgl. Primerlengte net genôch, dimer foarme tusken primers, ensfh.) -Resign primers (foarkomme foarming fan primer dimer en sekundêre struktuer)

A-3 Mg²⁺konsintraasje

■ Mg²⁺ konsintraasje is te leech —— Korrekt ferheegje Mg²⁺ konsintraasje: Optimalisearje de Mg²⁺ konsintraasje troch in searje reaksjes fan 1 mM oant 3 mM mei in ynterval fan 0,5 mM om de optimale Mg te bepalen²⁺ konsintraasje foar elke sjabloan en primer.

A-4 Annealing temperatuer

■ De hege gloeitemperatuer hat ynfloed op de bining fan primer en sjabloan. ——Ferminderje de annealtemperatuer en optimalisearje de kondysje mei in helling fan 2 ° C.

A-5 Utwreidingstiid

■ Koarte ferlingstiid —— Fergrutsje ferlingstiid.

Fenomenen: Negative samples litte ek de doelfolgjende bannen sjen.

A-1 fersmoarging fan PCR

■ Krúsbesmetting fan doelfolging as fersterkingsprodukten —— Foarsichtich it monster mei doelsekwinsje net foarsichtich pipette yn 'e negative stekproef of se út' e sintrifugebuis smite. De reagents of apparatuer moatte autoklave wurde om besteande nukleinsoeren te eliminearjen, en it bestean fan besmetting moat wurde bepaald troch negative kontrole -eksperiminten.

■ Kontaminaasje fan reagens ——Aliquot de reagentjes en bewarje se op lege temperatuer.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ konsintraasje is te leech —— Korrekt ferheegje Mg²⁺ konsintraasje: Optimalisearje de Mg²⁺ konsintraasje troch in searje reaksjes fan 1 mM oant 3 mM mei in ynterval fan 0,5 mM om de optimale Mg te bepalen²⁺ konsintraasje foar elke sjabloan en primer.

■ Unjildich primer-ûntwerp, en de doelfolging hat homology mei de net-doelfolging. —— Re-ûntwerp primers.

Fenomenen: De PCR-amplifikaasjebannen binne ynkonsistint mei de ferwachte grutte, itsij grut as lyts, of soms komme sawol spesifike amplifikaasjebannen as net-spesifike amplifikaasjebannen foar.

A-1 Primer

■ Slechte primer -spesifisiteit

—— Re-ûntwerp primer.

■ De primer -konsintraasje is te heech —— Fergrutsje de denaturaasje -temperatuer juste en ferlingje denaturaasje -tiid.

A-2 mg²⁺ konsintraasje

■ De Mg²⁺ konsintraasje is te heech ——Krekt ferminderje de Mg2+ konsintraasje: Optimalisearje de Mg²⁺ konsintraasje troch in searje reaksjes fan 1 mM oant 3 mM mei in ynterval fan 0,5 mM om de optimale Mg te bepalen²⁺ konsintraasje foar elke sjabloan en primer.

A-3 Thermostable polymerase

■ Oermjittich enzymbedrach ——Ferminderje enzymehoeveelheid passend mei yntervallen fan 0,5 U.

A-4 Annealing temperatuer

■ De gloeitemperatuer is te leech —— Passend ferheegje de annealtemperatuer as nim de twa-etappe gloeimetoade oan

A-5 PCR-syklusen

■ Te folle PCR -syklusen ——Ferminderje it oantal PCR -syklusen.

A-1 Primer——Slechte spesifisiteit ——Re-ûntwerp de primer, feroarje de posysje en lingte fan 'e primer om de spesifisiteit te ferbetterjen; of nêst PCR útfiere.

A-2 Template DNA

——De sjabloan is net suver—— Suverje de sjabloan as extract DNA mei suveringskits.

A-3 Mg²⁺ konsintraasje

——Mg²⁺ konsintraasje is te heech ——Properyk ferminderje²⁺ konsintraasje: Optimalisearje de Mg²⁺ konsintraasje troch in searje reaksjes fan 1 mM oant 3 mM mei in ynterval fan 0,5 mM om de optimale Mg te bepalen²⁺ konsintraasje foar elke sjabloan en primer.

A-4 dNTP

——De konsintraasje fan dNTP's is te heech ——Ferminderje de konsintraasje fan dNTP passend

A-5 Annealing temperatuer

—— Te lege annealtemperatuer —— Passend ferheegje de gloeitemperatuer

A-6 syklusen

——Tefolle syklusen——Optimalisearje it syklusnûmer

De earste stap is om de passende polymerase te kiezen. Regelmjittige Taq-polymerase kin net korrekturlêze fanwegen gebrek oan 3'-5 'eksonukleaseaktiviteit, en mismatch sil de útwreidingseffektiviteit fan fragminten sterk ferminderje. Dêrom kin gewoane Taq -polymerase doelfragminten grutter dan 5 kb net effektyf fersterkje. Taq -polymerase mei spesjale modifikaasje as oare high fidelity -polymerase moat wurde selekteare om de effisjinsje fan útwreiding te ferbetterjen en te foldwaan oan 'e behoeften fan amplifikaasje fan lange fragminten. Derneist fereasket de fersterking fan lange fragminten ek oerienkommende oanpassing fan primer-ûntwerp, denaturaasje-tiid, ferlingingstiid, buffer-pH, ensfh Normaal kinne primers mei 18-24 bp liede ta bettere opbringst. Om sjabloanskade te foarkommen, soe de denaturaasje -tiid by 94 ° C moatte wurde fermindere oant 30 sekonden of minder per syklus, en de tiid om temperatuer te ferheegjen nei 94 ° C foar amplifikaasje moat minder dan 1 min wêze. Boppedat kin de útwreidingstemperatuer ynstelle op sawat 68 ° C en it ûntwerpen fan de ferlingingstiid neffens de snelheid fan 1 kb/min kin soargje foar effektive amplifikaasje fan lange fragminten.

De flaterpersintaazje fan PCR -amplifikaasje kin wurde fermindere troch ferskate DNA -polymerasen te brûken mei hege trou. Under alle Taq DNA -polymerasen dy't oant no ta binne fûn, hat Pfu -enzym it leechste flaterfrekwinsje en de heechste trou (sjoch taheakke tabel). Neist enzyme -seleksje kinne ûndersikers de PCR -mutaasjesnelheid fierder ferminderje troch optimalisearjen fan reaksjebetingsten, ynklusyf optimalisearjen fan buffersammensetning, konsintraasje fan thermostabele polymerase en optimalisearjen fan PCR -syklusnûmer.