FastKing RT Kit (Mei gDNase)

A-1 RNA wurdt degradearre

——Zuverje RNA fan hege kwaliteit sûnder besmetting. It materiaal wêrfan RNA wurdt wûn moat sa fris mooglik wêze om RNA -degradaasje te foarkommen. Analysearje RNA -yntegriteit op denatureare gel foar RT -reaksje. Nei RNA -ekstraksje moat it wurde opslein yn 100% formamide. As RNase -ynhibitor wurdt brûkt, moat de ferwaarmingstemperatuer <45 ° C wêze, en de pH moat minder dan 8,0 wêze, oars sil de inhibitor alle gebonden RNase frijlitte. Boppedat moat RNase -ynhibitor wurde tafoege yn oplossingen mei ≥ 0.8 mM DTT.

A-2 RNA befettet remmers fan reverse transkripsjereaksjes

—— Reverse transkripsje -ynhibitoren omfetsje SDS, EDTA, glycerol, natriumpyrofosfaat, spermidine, formamide, guanidine -sâlt, ensfh. Mix de kontrôle RNA mei de stekproef, en fergelykje de opbringst mei de kontrôle RNA -reaksje om te kontrolearjen oft d'r in remmer is. Waskje RNA -delslach mei 70% (v/v) ethanol om remmers te ferwiderjen.

A-3 Unfoldwaande annealing fan primers brûkt foar it synthetisearjen fan de earste strân fan cDNA

—— Bepale dat de annealtemperatuer geskikt is foar de primers brûkt yn it eksperimint. Foar willekeurige hexamers wurdt it oanrikkemandearre om de temperatuer op 25 ° C te hâlden foar 10 min foardat de reaksjetemperatuer berikt. Besykje oare GSP foar gene-spesifike primers (GSP), of wikselje nei oligo (dT) as willekeurige hexamer.

A-4 Lyts bedrach start RNA

—— Fergrutsje it bedrach fan RNA. Foar RNA -samples minder dan 50 ng, kin 0.1 μg oant 0.5 μg acetyl BSA brûkt wurde yn 'e earste strân cDNA -synthese

A-5 De doelfolging wurdt net útdrukt yn 'e analysearre weefsels.

—— Besykje oare weefsels.

A-6 PCR-reaksje mislearret

—— Foar twa-stap RT-PCR kin it cDNA-sjabloan yn 'e PCR-stap net mear dan 1/5 fan it reaksjevolumint wêze.

A-1 Net-spesifike annealing fan primers en sjabloanen

—— It 3'-ein fan primers moat 2-3 dG as dC net befetsje. Brûk Gene-spesifike primers yn 'e earste strandsynthese ynstee fan willekeurige primers as oligo (dT). Brûk in hegere gloeitemperatuer yn 'e earste pear syklusen, en dan in legere gloeitemperatuer. Brûk hot-start Taq DNA-polymerase foar PCR om de spesifisiteit fan 'e reaksje te ferbetterjen.

A-2 Slecht ûntwerp fan genspesifike primers

——Folgje deselde prinsipes foar amplifikaasje -primer -ûntwerp.

A-3 RNA besmet mei genomysk DNA

——Treat RNA mei PCR-grade DNase I. Stel in kontrôlereaksje op sûnder reverse transkripsje om DNA-besmetting te detektearjen.

A-4 Foarming fan primer dimer

—— Untwerp primers sûnder komplementêre sekwinsjes oan 'e 3' ein.

A-5 Te heech Mg²⁺ konsintraasje

—— Optimalisearje Mg²⁺ konsintraasje foar elke sjabloan en primerkombinaasje

A-6 Kontaminearre mei frjemd DNA

——Gebrûk aerosolbestindige tips en UDG-enzymen.

A-1 De ynhâld fan it earste strandprodukt is te heech

——Ferminderje it bedrach fan it earste strandprodukt yn 'e konvinsjonele PCR -reaksjestap.

A-2 Te heech primerbedrach yn PCR-reaksje

——Ferminder primerynfier.

A-3 Te folle syklusen

—— Optimalisearje PCR -reaksjebetingsten en ferminderje PCR -syklusnûmer.

A-4 Te lege gloeitemperatuer

—— Fergrutsje annealtemperatuer om net-spesifike inisjatyf en útwreiding te foarkommen.

A-5 Net-spesifike amplifikaasje fan oligonukleotidefragminten genereare troch DNase-degradaasje fan DNA-Extract hege kwaliteit RNA om DNA-besmetting te foarkommen.

RT-PCR is om RNA transkribearje yn cDNA, en brûk dan it reverse transkribeare cDNA as sjabloan foar PCR-reaksje om it doelfragment te fersterkjen. Kies of willekeurige primers, Oligo dT en gene spesifike primers neffens de spesifike betingsten fan it eksperimint. Alle boppesteande primers kinne wurde brûkt foar koarte eukaryotyske sellen mRNA sûnder haarspeldstruktuer.

Willekeurige primer: Geskikt foar lange RNA mei haarspeldstruktuer, lykas alle soarten RNA lykas rRNA, mRNA, tRNA, ensfh. Se wurde benammen brûkt foar RT-PCR-reaksje fan ien sjabloan.

Oligo dT: Geskikt foar RNA mei PolyA -tailing (prokaryotyske RNA, eukaryotyske Oligo dT rRNA en tRNA hawwe gjin PolyA -staarten). Om't Oligo dT is bûn oan PolyA-sturt, is de kwaliteit fan RNA-monsters heech nedich, en sels in lytse degradaasje sil de hoemannichte cDNA-synthese yn folle lingte sterk ferminderje.

Gene-spesifike primer: Komplementêr foar de sjabloansekwinsje, geskikt foar situaasjes wêr't de doelfolging bekend is.

D'r binne twa manieren:

1. Ynterne referinsjemetoade: Yn teory is cDNA DNA -fragminten fan ferskate lingten, sadat it resultaat fan elektroforese smear is. As RNA -oerfloed leech is, sil gjin produkt ferskine yn elektroforese, mar dit betsjuttet net dat gjin produkt sil wurde fersterke troch PCR. Yn 't algemien kin ynterne referinsje wurde brûkt om cDNA te detektearjen. As de ynterne referinsje resultaten hat, kin de kwaliteit fan cDNA yn prinsipe wurde garandearre (yn in pear gefallen, as it doelgenfragment te lang is, kinne d'r útsûnderingen wêze).

2. As d'r in bekend gen is fersterke troch dit sjabloan, kin it wurde ferifieare troch de primers fan dit gen. De fersterking fan ynterne referinsje betsjuttet net needsaaklik dat d'r gjin probleem is mei cDNA. Om't ynterne referinsje hege oerfloed hat yn cDNA, is it maklik te fersterkjen. As cDNA om ferskate redenen foar in part wurdt degradearre, út it perspektyf fan kâns, wurde PCR -resultaten fan doelgenen mei lege oerfloed sterk beynfloede. Wylst ynterne referinsje noch altyd heech is yn oerfloed, sil de amplifikaasje wierskynlik net wurde beynfloede.

Foar in part degradearje fan RNA. Detektearje de yntegriteit en suverje fan RNA

De RNA -ynhâld fan ferskate soarten kin oars wêze, mar yn 't algemien moat it extracteare totale RNA twa dúdlike 28S- en 18S -bannen befetsje yn gelelektroforese, en de helderheid fan' e eardere band moat twa kear sa heech wêze as dy fan 'e lêste. De 5S -band jout oan dat RNA is degradearre, en de helderheid is evenredich mei de graad fan degradaasje. De suksesfolle amplifikaasje fan ynterne referinsje betsjuttet net dat d'r gjin probleem is mei RNA, om't de ynterne referinsje yn grutte oerfloed is, kin RNA wurde fersterke sa lang as de degradaasje net serieus is. De OD₂₆₀/OD₂₈₀ferhâlding fan suvere RNA metten mei spektrofotometer moat tusken 1.9 en 2.1 wêze. In lytse hoemannichte proteïne -ûnreinheid yn RNA sil de ferhâlding ferminderje. Salang't de wearde net te leech is, sil RT net wurde beynfloede. Wat it meast wichtich is foar RT is RNA -yntegriteit.

De útwreiding fan it ynterne referinsjegen kin allinich oanjaan dat RT is slagge, mar it is net needsaaklik besibbe oan 'e kwaliteit fan' e cDNA -strand. Om't de ynterne referinsjefragminten oer it algemien lyts binne yn grutte en heech yn ekspresje, binne se makliker suksesfol te wêzen yn reverse transkripsje. De grutte en ekspresje fan doelgen ferskilt lykwols fan gen oant gen. De cDNA -kwaliteit kin net allinich wurde beoardiele troch ynterne referinsje foaral foar de doelfragminten langer dan 2 kb.

Guon samples hawwe komplekse sekundêre struktueren, as hawwe in rike GC -ynhâld, of binne kostber mei lege oerfloed. Yn dizze gefallen soe passende reverse transkriptase moatte wurde selekteare neffens de grutte fan it doelfragmint en de stekproef. Foar RNA -sjabloanen mei hege GC -ynhâld en komplekse sekundêre struktuer is it lestich de sekundêre struktuer te iepenjen by lege temperatuer, as mei gewoane reverse transkriptase. Foar dizze sjabloanen kin Quant Reverse Transkriptase wurde selekteare, om't de prestaasjes fan reverse transkripsje fansels better binne dan dy fan M-MLV-serie reverse transkriptase, dy't ferskate RNA-sjabloanen effisjint kinne reverse en RNA transkribearje yn cDNA-earste strand oant de maksimale omfang. By it brûken fan algemiene reverse transkriptase kit, kin 20 μl systeem allinich 1 μg totale RNA transkribearje effektyf. Let asjebleaft op 'e maksimale RT -kapasiteit fan kit. As it sjabloan te folle wurdt tafoege, sil reverse transkripsje it RNA favorearje mei hege oerfloed. Dêrom is it better om de maksimum kapasiteit fan it systeem net te oersjen.

A-1 Bepale as RNA serieus wurdt degradeare en as RT suksesfol is

Yn 't algemien wurdt de reden foar it mislearjen fan ynterne referinsjefersterking faaks feroarsake troch serieuze degradaasje fan RNA. In oare mooglike reden is mislearre transkripsje. Ynterne referinsje kin net wurde brûkt as standert om de kwaliteit fan cDNA -ienstreng te beoardieljen, mar it kin wurde brûkt as standert om te beoardieljen oft reverse transkripsje suksesfol is as d'r gjin probleem is fan 'e RNA -kwaliteit. It wichtichste ding yn it omkearde transkripsjeproses is it hâlden fan in konstante temperatuer en in konstant reaksysteem om de reaksje -effisjinsje te ferbetterjen.

A-2 Bepaal of de primers foar it fersterkjen fan ynterne referinsjegenen betrouber binne en as d'r problemen binne mei reagents brûkt yn PCR.

Foar relative kwantifikaasje moat RNA kwantifisearre wurde foar reverse transkripsje, dat is ek fereaske yn in protte reverse transkripsjekits, bygelyks kwantifisearje de RNA -ynfier as 1 μg. Om't it omkearde transkribearre cDNA in mingde oplossing is, ynklusyf RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, en sels in bytsje DNA -residu, sil ôfwiking wurde feroarsake, dus it is ûnmooglik om it cDNA krekt te kwantifisearjen. Dêrom is RNA -kwantifikaasje needsaaklik. Yn betinken nommen dat de reverse transkripsje -effisjinsje itselde is ûnder ferskate samples, soe de hoemannichte cDNA krigen moatte deselde wêze, en de kwantitative analyse kin de fergeliking sjen fan ekspresjennivo's fan ferskate genen yn deselde hoemannichte totale RNA. By it útfieren fan kwantitative fluoreszens kwantitative PCR, is kwantitatyf cDNA miskien net fereaske nei reverse transkripsje, om't it ynterne referinsjegen kin fungearje as referinsje.

It is foaral besibbe oan 'e genen, en reverse transkripsje fan lang fragmint is net helber foar de measte genen. As earste is de effisjinsje fan reverse transkripsje fier leger dan dy fan PCR. Ten twadde beheine de GC -rike regio en sekundêre struktuer fan in protte genen sawol reverse transkripsje as PCR. Uteinlik binne de fidelity en amplifikaasje -effisjinsje fan PCR tagelyk lestich te garandearjen. Yn it proses fan reverse transkripsje kin gjinien garandearje lang fragment te krijen foar genen mei lege kopy, foaral mei oligo dT. Wat 5 'UTR mei mear GC oanbelanget, is it noch dreger. Dêrom is it noch in ridlike metoade om transkript werom te kearen mei willekeurige primers, de natuerlike splitsingsplakken te finen yn it doelfragmint, fersterke troch segminten, en dan de beheiningfertering en ligaasje útfiere. Yn 't algemien is it dreech om fragminten grutter dan 2 kb direkt te amplifisearjen, mar it is net altyd ûnmooglik om te krijen: 1. Earst fan alles garandearje de yntegriteit fan RNA/mRNA, en TRIZOL -ekstraksje hat de foarkar. 2.M-MLV RT-PCR-kit kin direkt wurde brûkt. Ferlengje gloeitiid en fergrutsje syklusnûmer yn it amplifikaasjeproses goed. As alternatyf kin nêst PCR wurde tapast, as ien of twa reaksjes earst útfiere mei passend ferlingde denaturaasje en ferlingingstiid foar normale PCR -fersterking, wat kin helpe om fragminten te ferlingjen. Soarch omtinken foar de trou fan 'e polymerase. 3.Lange Taq kin brûkt wurde yn PCR om ideale resultaten te krijen. 4. Foar applikaasje foar proteïne -ekspresje soe polymerase fan hege fidelity moatte wurde tapast.

D'r binne twa soarten reverse transkriptase oanbean troch TIANGEN: Quant/King RTase en TIANScript M-MLV. It wichtichste ferskil tusken har is ynfierbedrach fan sjabloanen. Quant is in unike reverse transkriptase, dy't ferskilt fan 'e gewoan brûkte M-MLV ôflaat fan Moloney murine leukemyfirus. Quant is in nije hege effisjinsje reverse transkriptase rekombinant útdrukt troch engineering Escherichia coli. Quant is geskikt foar it fersterkjen fan 50 ng-2 μg RNA mei hege reverse transkripsjonele aktiviteit en hege opbringst. Yn ferliking mei gewoane MMLV as AMV is Quant's grutste skaaimerk dat it heul sterke affiniteit hat mei RNA -sjabloanen en kin transkript komplekse sjabloanen reverse sûnder denaturaasje fan hege temperatueren. Foar sjabloanen mei hegere GC -ynhâld is de omkearde effisjinsje heger. Dizze reverse transkriptase hat lykwols RNase H -aktiviteit, dy't de lingte fan cDNA -produkt kin beynfloedzje (geskikt foar <4.5 kb sjabloanen). Foar konvinsjonele reverse transkripsje wurdt TIANScript MMLV reverse transkriptase oanrikkemandearre. Dizze RTase is in oanpast enzyme mei heul swakke RNase H -aktiviteit, dy't geskikt is foar lange (> 5 kb) cDNA -synthese.

Ien-stap reverse transkripsje en PCR-amplifikaasje binne foltôge yn deselde buis sûnder de buisdekking te iepenjen tusken cDNA-synthese en amplifikaasje, wat handich is om besmetting te ferminderjen. Om't alle verkregen cDNA -monsters wurde brûkt foar amplifikaasje, is de gefoelichheid heger, mei in minimum fan 0,01 pg fan totale RNA. Foar suksesfolle RTPCR yn ien stap, wurde genespesifike primers oer it algemien brûkt om cDNA-synteze te begjinnen. De metoade mei twa stappen, nammentlik reverse transkripsje en PCR-amplifikaasje wurdt útfierd yn twa stappen. Earst wurdt reverse transkripsje útfierd út in RNA -sjabloan om cDNA te krijen, en it verkregen cDNA wurdt ûnderwurpen oan ien of mear ferskillende PCR -reaksjes. De metoade mei twa stappen kin oligo (dT) as willekeurige primers brûke om de synteze fan 'e earste strân fan cDNA te begelieden, en kin alle mRNA-ynformaasje fan in spesifyk stekproef omkeare.