TIANSeq NGS -biblioteekfersterkingsmodule

Op it stuit is sequencingtechnology mei hege trochfier foaral basearre op sequencingtechnology fan folgjende generaasje. Om't de lêslengte fan folgjende generaasje sequencingtechnology beheind is, moatte wy de folchoarder fan folsleine lingte brekke yn lytse fragmintbiblioteken nei sekwinsje. Neffens de behoeften fan ferskate sequencing-eksperiminten kieze wy gewoanlik sequencing mei ien ein as sekwinsje mei dûbele einen. Op it stuit wurde de DNA-fragminten fan 'e folgjende generaasje sequencingbibleteek algemien ferdield yn it berik fan 200-800 bp.

a) DNA is min yn kwaliteit en befettet remmers. Brûk DNA-samples fan hege kwaliteit om remming fan enzymaktiviteit te foarkommen.

b) De hoemannichte DNA-monster is net genôch by it brûken fan PCR-fergese metoade om DNA-bibleteek te bouwen. As de ynfier fan it fragminteare DNA 50 ng grutter is, kin PCR-fergese workflow selektyf wurde útfierd tidens it bouproses fan 'e bibleteek. As it eksimplaarnûmer fan 'e bibleteek te leech is om direkt yn sekwinsje te wurden, kin de DNA -bibleteek wurde fersterke troch PCR nei de adapterligaasje.

c) RNA -fersmoarging liedt ta unakkurate initial DNA -kwantifikaasje RNA -besmetting kin bestean yn it suveringsproses fan genomysk DNA, wat kin liede ta unakkurate DNA -kwantifikaasje en ûnfoldwaande DNA -laden tidens bibleteekbou. RNA kin wurde ferwidere troch te behanneljen mei RNase.

A-1

a) Lytse fragminten (60 bp-120 bp) ferskynt Lytse fragminten binne meastal adapterfragminten as dimers foarme troch adapters. Suvering mei Agencourt AMPure XP magnetyske kralen kinne dizze adapterfragminten effektyf ferwiderje en sekwinsjekwaliteit garandearje.

b) Grutte fragminten ferskine yn 'e bibleteek nei PCR -amplifikaasje De grutte fan it DNA -fragmint fan' e bibleteek sil tanimme mei 120 bp neidat de adapter is ligeare. As it DNA -fragmint tanimt mei mear dan 120 bp nei de adapterligaasje, kin it wurde feroarsake troch abnormale fragmintamplifikaasje fan oermjittige PCR -amplifikaasje. It ferminderjen fan it oantal PCR -syklusen kin de situaasje foarkomme.

c) Abnormale grutte fan bibleteek DNA -fragminten nei adapterligaasje De lingte fan de adapter yn dizze kit is 60 bp. As de twa einen fan it fragmint oan 'e adapters ligeare, sil de lingte allinich tanimme mei 120 bp. As jo ​​in oare adapter brûke dan dy levere troch dizze kit, nim dan kontakt op mei de leveransier om relevante ynformaasje te leverjen, lykas adapterlengte. Soargje asjebleaft dat de workflow en operaasje fan 'e eksperimint de stappen folgje beskreaun yn' e hantlieding.

d) Abnormale DNA -fragmintgrutte foar de adapter -ligaasje De reden foar dit probleem kin wurde feroarsake troch ferkearde reaksjebetingsten tidens DNA -fragmintaasje. Ferskillende reaksjetiden moatte wurde brûkt foar ferskate DNA -ynfier. As de DNA-ynfier mear dan 10 ng is, advisearje wy de reaksjetiid fan 12 min te kiezen as de starttiid foar optimalisaasje, en de fragmintgrutte produsearre op dit stuit is foaral yn it berik fan 300-500 bp. Brûkers kinne de lingte fan DNA-fragminten ferheegje of ferminderje foar 2-4 min neffens har eigen easken om de DNA-fragminten te optimalisearjen mei de fereaske grutte.

A-2

a) Fragmentaasjetiid is net optimalisearre As it fragminteare DNA te lyts as te grut is, ferwize dan nei de Rjochtlinen foar seleksje fan fragmintaasjetiid foarsjoen yn 'e ynstruksje om de reaksjetiid te bepalen, en dit tiidpunt te brûken as in kontrôle, set ek in reaksjesysteem om 3 min te ferlingjen of yn te koartsjen om krekter oanpassing te meitsjen oer fragmintaasjetiid.

A-3

Abnormale ferdieling fan DNA fan DNA nei fragmintaasjebehandeling

a) Ferkearde dooimetoade foar fragmintaasjereagens, as it reagens is net folslein mingd nei ûntdûken. Thaw it 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagens op iis. Ienris ûntdutsen, mingje it reagens gelijkmatig troch foarsichtich oan 'e boaiem fan' e buis te flippen. Rôlje it reagens net!

b) It DNA -ynfiermonster befettet EDTA as oare fersmoargjende stoffen Fergrutting fan sâltionen en chelaterende aginten yn 'e DNA -suveringsstap is foaral wichtich foar it súkses fan it eksperimint. As DNA wurdt oplost yn 1 × TE, brûk dan de metoade foarsjoen yn 'e ynstruksje om fragmintaasje út te fieren. As de EDTA -konsintraasje yn 'e oplossing ûnwis is, wurdt it oanrikkemandearre it DNA te suverjen en op te lossen yn deionisearre wetter foar folgjende reaksje.

c) Unakkurate inisjele DNA -kwantifikaasje De grutte fan fersnippere DNA is nau besibbe oan de hoemannichte DNA -ynfier. Foardat fragmintaasjebehandeling is krekte kwantifikaasje fan DNA mei Qubit, Picogreen en oare metoaden essensjeel om de krekte hoemannichte DNA yn it reaksjesysteem te bepalen.

 d) De tarieding fan it reaksysteem folget de ynstruksje net Om it bêste effekt te garandearjen, moatte alle reaksje -ûnderdielen op iis wurde pleatst en de tarieding fan reaksysteem moat wurde útfierd nei folsleine koeling. Neidat de tarieding is foltôge, flikke asjebleaft as pipet om deeglik te mingjen. Net vortexje!

1. Unjildige mingmetoade (draaikolk, heftige oscillaasje, ensfh.) Sil abnormale ferdieling fan bibleteekfragminten feroarsaakje (lykas werjûn yn 'e folgjende figuer), en dus ynfloed hawwe op de kwaliteit fan' e bibleteek. Dêrom, as jo de reaksjeoplossing foar fragmintaasjemiks tariede, pipearje asjebleaft foarsichtich op en del om te mingjen, of brûk de fingertop om gelyk te flikken en te mingjen. Wês foarsichtich om net te mingjen mei vortex.

2. DNA mei hege suverens moat wurde brûkt foar bibleteekbou

■ Goede DNA -yntegriteit: De elektroforeseband is mear dan 30 kb, sûnder sturt

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1,7-1,9

3. Bedrach fan DNA -ynfier moat presys wêze It wurdt suggereare om Qubit- en PicoGreen -metoaden te brûken foar it kwantifisearjen fan DNA, ynstee fan Nanodrop.

4. De ynhâld fan EDTA yn DNA -oplossing moat wurde bepaald EDTA hat in grutte ynfloed op 'e fragmintaasjereaksje. As de ynhâld fan EDTA heech is, moat DNA -suvering wurde útfierd foar de folgjende test.

5. De oplossing foar fragmintaasjereaksje moat wurde taret op iis It fragmintaasjeproses is gefoelich foar reaksjetemperatuer en tiid (foaral nei it tafoegjen fan enhancer). Om de krektens fan reaksjetiid te garandearjen, tariede asjebleaft it reaksjesysteem op iis.

6. De fragmintaasje -reaksjetiid moat presys wêze De reaksjetiid fan 'e fragmintaasjestap sil direkt de grutte fan' e fragmintprodukten beynfloedzje, sadat de grutte ferdieling fan DNA -fragminten yn 'e bibleteek beynfloedet.

1. Hokker soart foarbyld is fan tapassing op dizze kit?

It tapasbere sample -type fan dizze kit kin totaal RNA of suvere mRNA wêze mei goede RNA -yntegriteit. As totale RNA wurdt brûkt foar it oanlizzen fan 'e bibleteek, wurdt it oanrikkemandearre om de rRNA -útputtingskit (Cat#4992363/4992364/4992391) te brûken om earst rRNA te ferwiderjen.

2. Kinne FFPE -samples wurde brûkt om bibleteek te bouwen mei dizze kit?

De mRNA yn FFPE -samples sil yn in bepaalde mjitte wurde degradeare, mei relatyf minne yntegriteit. By it brûken fan dizze kit foar de bibleteekskonstruksje wurdt it oanrikkemandearre de fragmintaasjetiid te optimalisearjen (de fragmintaasjetiid ynkoarte as fragmentaasje net útfiert).

3. Wat kin de ynsette segmint lichte ôfwiking ferskine mei de stapke foar seleksje fan grutte yn 'e produkthânlieding?

Grutte seleksje sil wurde útfierd yn strikte oerienkomst mei de stap foar seleksje fan grutte yn dit produkthânlieding. As d'r ôfwiking is, kin de reden wêze dat de magnetyske kralen net binne balansearre oant keamertemperatuer of net folslein mingd binne, de pipet net akkuraat is of de floeistof yn 'e tip bliuwt. It wurdt oanrikkemandearre om de tips te brûken mei lege adsorption foar it eksperimint.

4. Seleksje fan adapters yn bibleteekbou

De bouwkit foar bibleteek befettet gjin adapterreagens, en it wurdt oanrikkemandearre dizze kit te brûken tegearre mei TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC fan 'e bibleteek

Kwantitative deteksje fan bibleteek: Qubit en qPCR wurde brûkt om respektivelik de massa konsintraasje en molêre konsintraasje fan 'e bibleteek te bepalen. De operaasje is strikt yn oerienstimming mei it produkthânlieding. De konsintraasje fan 'e bibleteek sil oer it algemien foldwaan oan' e easken fan NGS -sekwinsje. Deteksje fan bibleteekdistribúsjebereik: Mei help fan Agilent 2100 Bioanalyzer om it distribúsjebereik fan bibleteek te detektearjen.

6. Seleksje fan fersterkingssyklusnûmer

Neffens de ynstruksjes is it oantal PCR-syklusen 6-12, en it oantal PCR-syklusen dat nedich is, moat wurde selekteare neffens de sample-ynfier. Yn bibleteken mei hege opbringst komt oerfersterking gewoanlik foar yn ferskate graden, wat wurdt manifesteare troch in wat gruttere pyk nei de pyk fan it doelberik yn 'e opsporing fan Agilent 2100 Bioanalyzer, as de ûntdekte konsintraasje fan Qubit is leger dan dy fan qPCR. Milde oer amplifikaasje is in normaal ferskynsel, dat gjin ynfloed hat op bibleteekfolging en folgjende gegevensanalyse.

7. Spikes ferskine yn it deteksjeprofyl fan Agilent 2100 Bioanalyzer

It ferskinen fan spikes yn Agilent 2100 Bioanalyzer -opspoaren is fanwegen de uneffektive fersnippering fan monsters, wêr't d'r mear fragminten sille wêze yn bepaalde grutte, en dit sil dúdliker wurde nei PCR -ferriking. Yn dit gefal wurdt it suggereare de grutte seleksje net út te fieren, dat wol sizze, de fersnipperingskondysje ynsteld op 94 ° C foar 15 min ynkubeare, wêr't de fragmintferdieling lyts en konsintrearre is, en de homogeniteit kin wurde ferbettere.